TRF, TR-FRET 및 HTRF

Time-Resolved Fluorescence(TRF)

형광의 세기(FI) 측정에는 나노 초 단위로 일시적으로 방출되는 Fluorescein과 같은 표준 형광단을 사용합니다. 샘플의 Excitation과 Emission의 측정은 동시에 발생합니다. Microplate Reader가 방출 측정의 Excitation Light 스크리닝에 매우 우수하지만, Well 또는 샘플에서 시료로부터 방출되는 일시적인 광선으로 인해 Excitation Light는 보통 배경값이 높습니다.

Time-resolved fluorescence(TRF)는 지속적인 형광을 방출하는 유로퓸 또는 터븀과 같은 란탄족 형광단을 이용하여 배경값을 감소시킵니다. 이러한 지속적인 형광은 밀리 초 단위 동안이므로, 펄스 광원(예: 플래시 램프)을 통한 형광단의 여기 후 지연 및 신호 측정(‘계수 창’)으로 일시적인 형광(나노 초 단위로만 지속)이 측정 전 안정되도록 합니다. Time-Resolved Fluorescence을 이용한 Assay는 크게 증가한 신호 대 잡음비를 제공합니다. 가장 빈번하게 사용되는 란탄족은 유로퓸, 터븀, 사마륨입니다. 이들은 우수한 신호 강도와 안전성을 가진 킬레이트나 크립테이트 복합체로 흔히 사용됩니다.

Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer(TR-FRET)

FRET 없음, FRET

공여체와 수용체는 멀리 떨어져 있음, 공여체와 수용체가 가까이 있음

TR-FRET은 형광의 time-resolved(TR) 측정과 fluorescence resonance energy transfer(FRET) 기술을 결합합니다. FRET assay에서는 생체분자(예: 단백질)를 제공체 및 수용체 형광단으로 표지합니다. 생체분자가 상호작용할 때, 제공체 및 수용체 형광단이 서로 가까워집니다. 이제, Donor가 여기된 경우, 방출 에너지를 수용체로 전달하여 특정 파장에서 형광이 방출되도록 할 수 있습니다. 수용체 및 Donor 형광 방출은 Microplate Reader를 통해 서로 구별되는 서로 다른 파장을 가지며, 이를 통해 생체분자 상호작용의 정량화가 가능합니다.

지속적인 형광을 방출하는 란탄족 형광단을 Donor로 사용하는 TR-FRET assay는 형광의 time-resolved 측정의 장점을 취하여 일시적인 배경 형광을 제거합니다. TR-FRET assay에서는 Donor 형광단의 지속적인 방출로 인해 일시적인 배경 형광이 약화된 후에도 두 Donor와 수용체 형광단 모두의 Excitation 및 Emission을 측정할 수 있습니다.

Homogeneous Time-Resolved Fluorescence(HTRF)

HTRF는 생체분자 상호작용 검출을 위해 Cisbio에서 개발한 다목적 TR-FRET 기술입니다. 일반적인 HTRF assay는 유로퓸 크립테이트를 제공체로, 유기 형광단 d2를 수용체로 사용합니다. 제공체 및 수용체는 후생유전학, 생체표지자 정량화, GPCR 신호전달 등을 포함한 응용 분야에서 다양한 생체분자를 표지하는 데 사용될 수 있습니다. HTRF assay에서는 Cisbio에 의해 인증된 HTRF 호환 가능 TRF 검출 모드를 이용하는 Microplate Reader가 필요합니다.