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형광 편광(FP)

 

형광 편광(FP)은 시약에서의 결합 반응을 모니터링하는 데 널리 사용되는 기법입니다. 단백질간 결합, DNA Hybridization, Enzyme 활성 등의 Biomolecule 의 결합/상호작용에 적용할 수 있는 기술로, 기초 과학분야부터 High Throughput Screening 까지 다양하게 접목됩니다.

평면 편광으로 여기되며 형광 표지된 작은 분자(추적자)는 추적자가 여기와 방출 사이의 시간 동안 빠른 속도로 떨어지기 때문에 대부분 탈편광을 방출합니다. 하지만 추적자가 훨씬 더 큰 분자에 결합하면 훨씬 느린 속도로 회전하여 방출된 광선이 대부분 편광 상태를 유지합니다.

 

 

형광 편광 G 인자

 

밀리 P, 즉 mP 단위로 표시되는 편광은 편광 여기광(아래 공식 참조)의 방향과 관련되어 검출된 직각(Iperp) 및 평행(Ipara) 형광의 세기 값의 측정 수치에서 계산됩니다. G 인자(G)는 편광 값에 영향을 줄 수 있는 필터, 편광자 및 단색기와 같은 광학 구성품의 영향을 수정하는 데 사용됩니다.

 

공식

비결합 추적자

더 큰 분자에 결합된 추적자

형광 표지된 분자 또는 추적자가 결합된 분자가 클수록 mP 값도 커집니다.

형광 편광 G 인자

다른 결합 assay 대비 FP의 장점

 

FP는 수용기-리간드 상호작용, 단백질-DNA 상호작용, 단백질 가수분해, 막 유동성, 효소 assay 등을 연구하는 목적으로 사용할 수 있습니다. FP assay는 키나아제, 포스파타아제, 프로테아제, GPCR(G protein-coupled receptor) 및 핵 수용기 등 매우 다양한 표적을 성공적으로 조사하는 데 사용되어 왔습니다.

다음과 같은 이점 때문에 FP assay는 특히 high-throughput screening이 가능합니다.

  • 균질화(세척 단계가 필요하지 않음)
  • 비방사성
  • 비율비교(단일 파장)
  • 소형화 가능

SpectraMax Multi-Mode Microplate Reader 에서 IMAP phosphodiesterase assays

 

Molecular Devices의 IMAP® 기술은 키나아제, 포스파타아제 및 포스포디에스테라아제의 고속, 균질화 및 비방사성 assay를 지원하며 assay 개발과 high-throughput screening 모두에 적합합니다. IMAP assay는 나노입자의 고정 금속 배위 복합체에 인산을 결합하는 것에 기반을 두고 있습니다. IMAP 결합 독립체가 인산화된 기질에 결합하면 펩티드의 분자 이동이 변하여 펩티드에 부착된 형광 표지의 형광 편광(FP)은 증가합니다(그림 1, 좌측). Assay의 TR-FRET 버전에서 터븀(Tb) 제공체를 포함시키면 인산화된 기질이 있는 경우 형광 에너지 전달이 이루어지게 합니다(그림 1, 우측). 이 assay는 time-resolved 모드에서 검출되는데, 이를 통해 스크린에서 assay 구성품 또는 화합물의 형광 간섭을 사실상 제거합니다. 또한 TR-FRET은 기질 크기와 농도에 있어서 유연성을 제공합니다.

고리형 뉴클레오티드 포스포디에스테라제(PDE)는 다양한 생물학적 과정에 관련된 2차 전달자인 cAMP와 cGMP의 포스포디에스테르 결합을 분해하는 일련의 효소입니다. 심장 질환, 치매, 우울증 및 기타 질환 등의 영역에서 임상적 유의성으로 인해 약물 사용이 가능한 주요 등급 표적으로 부상해 왔습니다. 여기에서 당사는 PDE 효소 희석 및 억제 곡선이 SoftMax® Pro 소프트웨어가 탑재된 SpectraMax® 다중모드 마이크로플레이트 리더기를 통해 IMAP 기술로 수행되는 방법을 보여줍니다.

 

IMAP FP 및 TR-FRET 포스포디에스테라아제 assay 원리

 

그림 1: 포스포디에스테라아제 반응은 형광으로 표지된 기질을 사용하여 수행됩니다. 그런 다음 큰 M(III) 기반 나노입자가 함유된 결합 용액이 추가됩니다. FP 판독(좌측)에서 인산화된 작은 형광 기질은 기질의 회전 속도를 감속시켜 형광 편광을 증가시키는 큰 나노입자에 결합됩니다. TR-FRET 판독(우측)에서 인산화된 기질과 Tb 제공체 둘 다 나노입자에 결합되어, Tb 제공체가 기질의 플루오레세인 수용체에 매우 인접하게 접근하고 FRET을 활성화합니다.

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세포주 개발에서 IgG 측정을 위한 워크플로 간소화

 

IgG 생산 측정은 단일클론항체의 개발 및 제조와 관련된 여러 단계에서 중요한 단계입니다. IgG 정량화에 일반적으로 사용되는 방법에는 HPLC 및 표면 간섭 측정 또는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)와 같은 시간이 소비되는 assay 등 특수 기구 및 숙련된 직원이 필요합니다. ELISA는 잘 확립된 단백질 정량 방법이지만 여러 단계로 구성된 긴 공정입니다. 여기에서 당사는 항체 개발 및 제조 공정 중에 IgG titer를 측정하기 위한 Valitacell의 Valita®TITER assay 사용을 소개합니다.

ValitaTITER는 형광 편광(FP) 기술을 이용한 IgG Fc와 단백질 G의 상호작용 검출을 기반으로 합니다. 96웰 마이크로 역가 플레이트의 각 웰은 형광 표지된 IgG 결합 펩티드인 단백질 G로 코팅되어 있습니다. 웰에 샘플을 추가하면 단백질 G 분자는 재현탁되고 결합이 이루어집니다. 단백질 G의 분자 이동 속도는 항체와 결합했을 때 줄어들어 FP 값이 증가합니다(그림 2).

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FP 기술을 이용한 ValitaTITER assay 원리

그림 2: 자유 단백질 G 분자는 더 작아서 버퍼 용액에서 더 빠르게 회전합니다. 그 결과, 편광 여기광은 편광을 상실합니다(상단). 단백질 G 분자가 샘플의 항체와 결합하면 더 큰 복합체의 회전이 느려져서 FP 값이 증가됩니다(하단).

  • Fluorescence polarization assay (FP: 형광편광) 분석의 최적화와 확립

    Fluorescence polarization assay (FP: 형광편광) 분석의 최적화와 확립

    이 기술 노트는 사용자가 기존 assay를 확실한 형광 편광 형식으로 변환하기 위한 최적의 실험 조건을 정의하는 데 도움이 되는 정보를 제공할 목적으로 설계되어 있습니다. 예를 들어 수용체-리간드 결합을 평가하는 데 자주 사용되는 경쟁력 있는 결합 assay 유형이 있습니다. 형광 편광의 기본 원리를 숙지하고 있다고 가정합니다.

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    IMAP FP 키나아제 assay

    IMAP FP 키나아제 assay

    단백질 키나아제는 여러 가지 세포 과정의 조절에 중요합니다. 최근 몇 년 동안 암과 그 외 여러 가지 질환에 대한 가장 중요한 약물 표적 부류 중 하나로 부상해 왔습니다. Molecular Devices의 IMAP® 기술은 다양한 키나아제의 고속, 비방사성 assay를 지원하며 assay 개발과 high-throughput screening 둘 다에 적합합니다.

  • IMAP 포스포디에스테라아제 assay

    IMAP 포스포디에스테라아제 assay

    IMAP 기술은 키나아제, 포스파타아제 및 포스포디에스테라아제 스크리닝을 위한 균질화 비항체 기반 플랫폼을 제공합니다. 안정적이고 확실하며, 소형화가 가능하고 뛰어난 Z 인자 값으로 고품질의 데이터를 제공하기 때문에 억제제 스크리닝에 적합합니다. 다른 몇 가지 방법과는 달리, IMAP는 직접 결합을 측정하여 보다 관련성 있는 결과를 도출합니다. 또한 IMAP TR-FRET assay는 직접적인 Km 확인을 지원합니다.

    IMAP 기술

    IMAP 기술

    지금까지는, 방사성 동위원소 또는 특이성이 높은 항체를 이용하여 키나아제 활성 assay를 수행해 왔습니다. 이를 해결하기 위해, Molecular Devices는 독점적인 IMAP® 기술을 도입하여, 기질 펩티드 서열에 대한 고려 없이 매우 다양한 키나아제에 적용 가능한 비방사성, 균질화 assay를 제공하고 있습니다. 이 assay는 효소 활성을 정확하게 확인할 수 있는 단순한 '혼합 및 판독' 절차입니다.

  • Transcreener ADP2 assay

    Transcreener ADP2 assay

    Transcreener® ADP2 Assay는 단백질과 지질 키나아제 등의 확립된 약물 표적은 물론 탄수화물 키나아제, 트리포스파타아제, 열충격단백질 및 기타 ATPase와 같은 새로운 표적의 검출 및 스크리닝을 지원하는 형광 판독 기능의 균질화 assay입니다. Assay는 ADP의 면역 검출을 기반으로 하고 있습니다. 사용자의 요구사항과 검출 형식 선호도에 맞춘 세 가지의 검출 모드는 형광 편광(FP), time-resolved Forster-resonance energy transfer(TR-FRET) 및 형광의 세기(FI)입니다.

    ValitaTITER assay

    ValitaTITER assay

    ValitaTITER assay는 세포주 개발 워크플로에서 IgG의 정밀하고 신속한 정량을 위한 균질화 고처리량 방법입니다. 이 96웰 assay는 안정적인 결과를 보장하기 위한 FP 검출 기능이 포함된 SpectraMax iD5 리더기 및 다른 Molecular Devices 플레이트 리더기에서 완전히 검증되었습니다. SoftMax Pro 소프트웨어는 검출 설정 시간을 최소화하고 표준 곡선 적합 및 샘플 정량을 자동화합니다.

형광 편광(FP) 자료

동영상 및 웨비나

Microplate Reader, ELISA 에서 AlphaScreen 까지

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