형광 편광(FP)

형광편광(FP)은 시약에서의 결합 반응을 모니터링하는 데 널리 사용되는 기법입니다. 단백질간 결합, DNA Hybridization, Enzyme 활성 등의 Biomolecule의 결합/상호작용에 적용할 수 있는 기술로, 기초 과학 분야부터 High-Throughput Screening까지 다양하게 접목됩니다.

평면 편광으로 Excitation되며 형광 표지된 작은 분자(추적자)는 추적자가 Excitation과 Emission 사이의 시간 동안 빠른 속도로 떨어지기 때문에 대부분 탈편광을 방출합니다. 하지만 추적자가 훨씬 더 큰 분자에 결합하면 훨씬 느린 속도로 회전하여 방출된 광선이 대부분 편광 상태를 유지합니다.

형광 편광 G 인자

밀리 P, 즉 mP 단위로 표시되는 편광은 편광 Excitation Light(아래 공식 참조)의 방향과 관련되어 검출된 직각(Iperp) 및 평행(Ipara) 형광의 세기 값의 측정 수치에서 계산됩니다. G 인자(G)는 편광 값에 영향을 줄 수 있는 필터, 편광자 및 단색기와 같은 광학 구성품의 영향을 수정하는 데 사용됩니다.

비결합 추적자

더 큰 분자에 결합된 추적자

형광 표지된 분자 또는 추적자가 결합된 분자가 클수록 mP 값도 커집니다.

형광 편광 G 인자

다른 결합 assay 대비 FP의 장점

FP는 수용기-리간드 상호작용, 단백질-DNA 상호작용, 단백질 가수분해, 막 유동성, 효소 assay 등을 연구하는 목적으로 사용할 수 있습니다. FP assay는 Kinase, Phosphatase, 프로테아제, GPCR(G protein-coupled receptor) 및 핵 수용기 등 매우 다양한 표적을 성공적으로 조사하는 데 사용되어 왔습니다.

다음과 같은 이점 때문에 FP assay는 특히 high-throughput screening이 가능합니다.

균질화(세척 단계가 필요하지 않음)
비방사성
비율비교(단일 파장)
소형화 가능

SpectraMax Multi-Mode Microplate Reader에서 IMAP Phosphodiesterase Assay

Molecular Devices의 IMAP® 기술은 Kinase, Phosphatase 및 포스포디에스테라아제의 고속, 균질화 및 비방사성 assay를 지원하며 assay 개발과 high-throughput screening 모두에 적합합니다. IMAP assay는 나노입자의 고정 금속 배위 복합체에 인산을 결합하는 것에 기반을 두고 있습니다. IMAP 결합 독립체가 인산화된 기질에 결합하면 펩티드의 분자 이동이 변하여 펩티드에 부착된 형광 표지의 형광 편광(FP)은 증가합니다(그림 1, 좌측). Assay의 TR-FRET 버전에서 터븀(Tb) 제공체를 포함시키면 인산화된 기질이 있는 경우 형광 에너지 전달이 이루어지게 합니다(그림 1, 우측). 이 assay는 time-resolved 모드에서 검출되는데, 이를 통해 스크린에서 assay 구성품 또는 화합물의 형광 간섭을 사실상 제거합니다. 또한 TR-FRET은 기질 크기와 농도에 있어서 유연성을 제공합니다.

고리형 뉴클레오티드 포스포디에스테라제(PDE)는 다양한 생물학적 과정에 관련된 2차 전달자인 cAMP와 cGMP의 포스포디에스테르 결합을 분해하는 일련의 효소입니다. 심장 질환, 치매, 우울증 및 기타 질환 등의 영역에서 임상적 유의성으로 인해 약물 사용이 가능한 주요 등급 표적으로 부상해 왔습니다. 여기에서 당사는 PDE Enzyme 희석 및 억제 곡선이 SoftMax® Pro 소프트웨어가 탑재된 SpectraMax® Multi-Mode Microplate Reader를 통해 IMAP 기술로 수행되는 방법을 보여줍니다.

IMAP FP 및 TR-FRET 포스포디에스테라아제 assay 원리

그림 1: 포스포디에스테라아제 반응은 형광으로 표지된 기질을 사용하여 수행됩니다. 그런 다음 큰 M(III) 기반 나노입자가 함유된 결합 용액이 추가됩니다. FP 판독(좌측)에서 인산화된 작은 형광 기질은 기질의 회전 속도를 감속시켜 형광 편광을 증가시키는 큰 나노입자에 결합됩니다. TR-FRET 판독(우측)에서 인산화된 기질과 Tb 제공체 둘 다 나노입자에 결합되어, Tb 제공체가 기질의 플루오레세인 수용체에 매우 인접하게 접근하고 FRET을 활성화합니다.

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Cell line development에서 IgG 측정을 위한 실험과정 간소화

IgG 생산 측정은 단일클론항체의 개발 및 제조와 관련된 여러 단계에서 중요한 단계입니다. IgG 정량화에 일반적으로 사용되는 방법에는 HPLC 및 표면 간섭 측정 또는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)와 같은 시간이 소비되는 assay 등 특수 기구 및 숙련된 직원이 필요합니다. ELISA는 잘 확립된 단백질 정량 방법이지만 여러 단계로 구성된 긴 공정입니다. 여기에서 당사는 항체 개발 및 제조 공정 중에 IgG titer를 측정하기 위한 Valitacell의 Valita®TITER assay 사용을 소개합니다.

ValitaTITER는 형광 편광(FP) 기술을 이용한 IgG Fc와 단백질 G의 상호작용 검출을 기반으로 합니다. 96웰 마이크로 역가 플레이트의 각 웰은 형광 표지된 IgG 결합 펩티드인 단백질 G로 코팅되어 있습니다. 웰에 샘플을 추가하면 단백질 G 분자는 재현탁되고 결합이 이루어집니다. 단백질 G의 분자 이동 속도는 항체와 결합했을 때 줄어들어 FP 값이 증가합니다(그림 2).

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FP 기술을 이용한 ValitaTITER assay 원리