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GPCR(G protein-coupled receptor)

GPCR(G protein-coupled receptor)

GPCR(G protein-coupled receptor)은 세포 외 물질을 인식하고 세포막을 통해 신호를 전달하는 세포 표면에 위치한 단백질입니다. GPCR은 세포 내부의 신호 전달을 담당하는 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질(G 단백질)을 활성화하여 이를 수행합니다. 신호 전달은 cell growth, 유전자 전사, 번역 후 변형 및 다른 세포와의 소통을 포함한 다양한 세포 반응에서 매우 중요합니다. 이는 신체가 위협을 느낄 때의 심박수 증가, 또는 희미한 빛에 반응한 시력의 변화와 같은 환경적 변화에 적응하도록 신체를 조정합니다.

사람 유전체는 무엇보다도 호르몬, 지질, 아민, 신경 전달 물질 및 빛을 감지하는 최소한 1,000개의 서로 다른 GPCR로 구성됩니다.

GPCR은 3개의 영역으로 구성됩니다. 세포 외부 영역이 리간드를 감지하고 결합합니다. 그런 다음, 7개의 막관통 영역이 구조적으로 변화합니다. 마지막으로, 이러한 변화는 해당 G-단백질의 활성을 촉진하는 C-말단을 활성화합니다.


심근세포 Screening

iPS 세포 유래 심근세포는 고유 심근세포와 유사한 표현형 특성뿐만 아니라 유전자 발현 프로파일을 나타내므로 특히 매력적인 세포 모델입니다.

GPCR(G protein-coupled receptor) 및 이온채널

 

GPCR은 600~1000개의 구성원이 있는 가장 큰 단백질군으로, 병리학적 조건을 비롯하여 여러가지 정상적인 생물학적 조건과 연관됩니다. 7-막관통(7-TM) 수용체로도 알려져 있으며, 현대 의약품의 약 45%가 이 단백질 부류를 표적으로 합니다. GPCR의 기능은 매우 다양하며, 광자, 저분자, 단백질을 포함한 광범위한 리간드를 인식할 수 있습니다.

이온채널이란 이온이 세포 내외를 통과할 수 있도록 하는 cellular pathway의 구멍입니다. 사람 유전체에는 이온 채널과 관련된 400개 이상의 유전자가 있습니다. 이 중 다수를 현재의 블록버스터 약물들이 표적으로 삼고 있습니다. 이온 채널 활성을 직접 측정하려면 기존 전기생리학 기기를 이용하여 패치 클램프 기법으로 측정할 수 있으나, 처리량이 매우 적습니다. 또한, 세포막 전위, 칼슘 흐름, 칼륨 흐름의 변화에 민감한 형광단을 이용하면 더 높은 처리량으로 이온 채널 활성을 간접적으로 측정할 수도 있습니다.

 

신약 개발을 위한 GPCR 활성 Monitoring

 

GPCR 활성의 변화는 세포 신호전달 경로의 이상으로 이어져 염증, 심혈관 질환, 정신 장애, 호르몬 불균형 및 암을 유발합니다. 이것이 바로 GPCR이 신약 개발에서 중요한 이유이며, FDA 승인을 받은 모든 약물의 약 34%가 108 잘 정의된 GPCR을 표적으로 삼고 있습니다.

다양한 assay를 신약 개발에 사용하여 GPCR 활성 및 해당 세포 내 변화를 monitoring할 수 있습니다.

칼슘은 GPCR 활성에 의해 촉진되는 중요한 전달자입니다. 따라서 세포 내 칼슘 신호의 변화는 GPCR의 활성 상태를 나타내는 강력한 지표입니다. 칼슘 흐름 assay는 약물 screening에서 세포 내 칼슘 농도를 monitoring하는 데 사용할 수 있습니다.

또한 칼슘 진동 Monitoring은 후보 약물의 시험관 내 독성을 예측하는 데 중요합니다.

cAMP(Cyclic Adenosine Monophosphate)는 신호전달 경로에 관여하는 또 다른 중요한 전달자입니다. 세포 내 cAMP 농도의 변화는 특정한 GPCR-G 단백질 결합을 나타냅니다. cAMP 분석은 GPCR 하위 유형과 관련된 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다.

리간드 결합 시 GPCR 탈민감화에 주로 중점을 둔 transfluor assay를 사용하여 GPCR 활성을 monitoring하는 것도 가능합니다. 이러한 assay는 GPCR 활성/비활성 및 세포막을 통과하는 움직임을 Monitoring하기 위해 약물 Screening에 도입될 수 있습니다.

 

GPCR에 대한 초기 선도물질을 식별하기 위한 솔루션

 

당사는 assay 키트, 세포 screening 및 Imaging 시스템, Microplate Reader를 포함하여 GPCR과 이온채널 기능에 대한 연구를 지원하는 다양한 assay 및 분석기기 솔루션을 제공합니다.

여기서는 FLIPR High-Throughput Cellular Screening 시스템, Screenworks Peak Pro 2 소프트웨어 모듈을 다양한 FLIPR assay 키트와 함께 사용하여 독성학 및 선도물질 약물 식별을 위한 High-Throughput 동역학 screening 솔루션을 제공하는 응용 분야에 중점을 둡니다.

 

  • 심근세포

    심근세포

    약물로 인한 기능적 심장 독성을 조기에 예측하려면 high-throughput screening에 적합하고 로버스트한 in vitro 시스템이 필요합니다. 쉽게 구할 수 있는 iPSC 유래 인간 심근세포를 칼슘에 민감한 염색시약과 함께 사용하면 GPCS와 이온채널 모두에 대한 반응으로 세포 내 칼슘의 변화를 이용해 심박수 및 패턴을 모니터링할 수 있습니다. 이러한 칼륨 피크는 당사의 ScreenWorks Peak Pro 2 software 소프트웨어로 분석할 수 있으며, 이 소프트웨어는 연구자들이 심근세포 활성을 정량화할 수 있도록 하는 강력한 도구를 제공합니다.

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    심장독성: 칼슘 진동

    심장독성: 칼슘 진동

    유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 심근세포는 심장 기능과 안전성 둘 다에 대한 약물 효과 평가에 사용되므로 특히 매력적인 시험관 내 모델 시스템입니다. 칼슘 신호 진동은 세포질 칼슘 농도의 변화를 반영하므로 EarlyTox Cardiotoxicity Kit와 같이 칼슘에 민감도가 높은 염색시약을 사용할 수 있습니다.

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  • 칼슘 흐름의 평가

    칼슘 흐름

    칼슘 흐름 평가는 세포 활성을 측정하기 위해 오랫동안 사용되고 인정받아 온 방법입니다. 칼슘 흐름은 그 중 신경 전달 물질의 방출, GPCR 활성, 리간드 개폐형 이온채널, 심근세포 박동 패턴을 포함한 다수의 세포 과정을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. FLIPR 시스템은 사용이 편리하고, 민감도와 사용자 설정 기능을 갖추어 High-Throughput 및 Ultra-High-Throughput Screening으로 칼슘 흐름을 평가하는 신약 개발 도구입니다.

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    Fura-2 QBT 칼슘

    Fura-2 QBT 칼슘

    Fura-2 염색시약은 오랫동안 세포 이미징에서 칼슘 동원, GPCR 매개 세포 내 칼슘 흐름 및 이온채널 활성을 측정하는 중요한 도구로 여겨져 왔습니다. 이 비율비교 염색시약은 결합된 지시자과 유리 지시자 사이의 형광의 세기 비율을 계산하여 염색시약의 로딩 또는 세포 플레이팅의 assay 불일치를 교정하는 데 도움이 됩니다. 그러나 세척이 필요하므로 well 간 변동성이 증가하고 각 assay에 걸리는 시간이 늘어나고 복잡성이 증가합니다.

    Molecular Devices의 Fura-2 QBT™ 칼슘 키트와 비율비교 Fura-2 칼슘 지시약을 사용한 검증된 퀀치 기반 기술을 통합하여 세포 기반 변동성을 최소화하는 homogeneous assay를 제공하는 동시에 측정 전 세포 세척이 필요하지 않아 샘플처리량을 증가시킵니다.

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  • GPCR Assay를 위한 균질화 솔루션

    GPCR Assay를 위한 균질화 솔루션

    Cell Based Assay는 초기 신약 개발 과정에서 스크리닝 및 화합물 프로파일링에 필수적인 방법이 되었습니다. 현재까지 이 assay는 Receptor 특성 분석 연구, 일차 스크리닝 캠페인, 화합물 프로파일링 프로그램에서 가장 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 방법 중 일부로 입증된 바 있습니다. 특히 Gq 결합 GPCR 표적에는 마스킹 기술을 이용한 균질화 형광 칼슘 흐름 assay가 적합한 방법론입니다.

    FLIPR 칼슘 5 Assay 키트는 새로운 형광단과 검증된 Masking Technology를 결합하여 신뢰할 수 있는 약리, 더 큰 Signal Window, 개선된 Assay 성능을 제공합니다. FLIPR Calcium 5 Assay Kit 및 FLIPR 시스템을 이용하면, 특히 칼슘 신호 반응이 작은 다양한 수용체와 표적에 대한 일관된 screening 결과를 쉽게 사용할 수 있는 균질화 형식으로 얻을 수 있습니다.

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    Live Cell Gi 및 Gs 결합 GPCR 이차 전달자의 신호전달

    GPCR 이차 전달자 신호전달

    Gi 및 Gs 결합 GPCR 이차 전달자의 신호 활성은 기존에는 세포 용해가 요구되는 방사성 결합 또는 엔드포인트 cAMP assay와 같은 assay를 이용하여 검출하였습니다. 이러한 assay는 세포 반응의 단일 시점에서 활성을 측정하며, 동역학 정보는 제공하지 않습니다. 또 다른 옵션은 Gi 및 G 결합 GPCR을 Gα16에 강제 결합한 뒤, 작용제로 인해 활성화된 수용체의 칼슘 흐름을 형광 검출하는 것입니다. 그러나 이 assay는 생물학적으로 연관성이 있는 cAMP 경로를 통해 신호를 전달하지 않으므로 최적의 방법은 아닙니다.

    우리는 여기에서 FLIPR 시스템을 이용하여 GloSensor 플라스미드를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 및 HEK-293 세포주에서 내인성 수용체의 활성을 입증합니다.

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  • Live Cell 동역학 Assay

    생세포 동역학 Assay

    ImageXpress Confocal 및 Micro 4 High-Content Imaging 시스템은 선택적인 유체 공학 및 Environmental Control 모듈을 제공하여, 빠른 동역학 또는 장기 Timelapse 실험 중 단일 채널 Pipette으로 화합물을 첨가할 수 있으며 배지 교환이 가능하도록 합니다. Transfluor Cell-Based GPCR Assay Kit는 HCS(High Content Screening) 과정에서 자동화된 이미지 분석으로 GFP 표지 ß-아레스틴을 사용한 GPCR 탈민감과 재생을 정량화하여 GPCR(G protein-coupled receptor) 활성을 추적하기 위해 사용되는 유용한 도구입니다.

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    세포 내 칼슘 흐름 측정하기

    세포 내 칼슘 측정의 비교

    GPCR(G protein-coupled receptor)은 세포 신호전달에서 중요한 역할을 합니다. 리간드에 의해 수용체가 활성화되면, 수용체 구조가 변화하면서 세포 내에서 G 단백질의 활성화가 촉진됩니다. 활성 G 단백질은 칼슘을 포함한 세포 내 전달자의 다양한 캐스케이드를 유도할 수 있습니다. FLIPR 시스템은 High-Throughput의 기능적 Cell Based Assay를 수행하며, 칼슘에 민감한 형광 Reporter Dye의 사용을 통해 검출된 세포 내 칼슘 변화를 평가하므로 신약 개발에 적합한 시스템입니다. 우리는 여기에서 균질화, 신속하며 믿을 수 있는 형광 Assay인 FLIPR® 칼슘 Assay 키트를 이용하여 FLIRP 시스템에서 칼슘 동원 Assay를 수행하기 위한 기본적인 프로토콜을 제시합니다.

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  • Monitoring Gq-coupled protein receptor activity

    Gq-Coupled Protein Receptor Activity 모니터링

    일반적으로 Gq protein-coupled receptor activation은 형광(Fluorescence) Plate Reader에서 칼슘 민감성 염료를 이용하여 실시간으로 Live Cell에서 모니터링됩니다. 플레이트 리더기 내에서 자동으로 액체를 처리하여 작용제 화합물을 마이크로플레이트의 세포로 옮기고, 검출 시스템이 실시간으로 형광 강도값의 화합물 유도 변화를 판독합니다. 동역학 결과의 판독값 분석은 작용제와 길항제의 EC50 및 IC50 값을 포함한 화합물 반응 프로파일에 대한 정보를 도출합니다.

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    신경세포 Assay

    신경세포 Assay

    FLIPR 시스템은 신경세포 활성과 관련된 칼슘 흐름을 모니터링하는 훌륭한 도구입니다. 새롭게 개발된 상업화용 iPSC 뉴런으로 High-throughput 신경세포 스크리닝을 실제로 사용할 수 있게 되었습니다. 이러한 세포 및 assay는 신경세포 배양 조건, 약물 화합물 효과, 환경 신경독성의 효과를 포함한 다양한 인자를 모니터링하는 데 필수적입니다. 형광 기반 칼슘 지시약 염료를 이용하여 신경세포 활성과 신경전달물질 방출을 평가할 수 있으며, 처리량 규모 조절이 가능한 빠르고 단순하며, 강력한 assay와 결합될 수 있습니다.

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GPCR(G protein-coupled receptors) 자료

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