Cell Counter
Cell Counter: MCF-7 Cells
10월은 유방암의 달이므로 MCF-7 유방암 세포주를 집중 조명하기로 결정했습니다. 1970년도에 캐서린 프란시스(Helen Marion) 말론 수녀에게서 유래한 이 세포주가 생성된 미시간 암 재단(Michigan Cancer Foundation)의 이름을 따서 명명되었습니다. MCF-7은 상당한 수치의 Estrogen Receptor(ER) alpha가 발현되는 희귀한 유방암 세포주 중 하나이므로, 연구자들이 ER Positive 유방암을 연구할 수 있는 모델 시스템을 제공합니다. PubMed에 'MCF-7 세포'를 입력하면 이 주목할 만한 세포주와 관련된 20,000개 이상의 참고문헌을 찾을 수 있습니다.
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그림 1: SpectraMax Minimax Cytometer를 이용해서 얻은 이미지
MCF-7 세포는 EarlyTox™ Live Red Dye로 염색한 다음 SpectraMax Minimax Cytometer로 이미징하였습니다. 세포를 식별하기 위해 custom setting을 사용하였습니다. A: Transmitted Light Image, B: EarlyTox Live Red Dye로 염색한 핵, C: StainFree Analysis을 이용하여 식별된 세포(자색 마스크는 소프트웨어로 식별된 세포를 나타냄).
그림 2: StainFree 세포 계수 vs. 형광 세포 계수
156~20,000cell/well로 MCF-7 cell을 Seeding하고, 핵은 EarlyTox Live Red Dye로 염색했습니다. 웰당 세포 수가 4개인 영역에서 이미지를 획득하였으며, 분석을 위해 웰 중앙의 대상 영역을 선택하였습니다. 이후, StainFree 방법(청색 그래프) 또는 적색 형광 핵(적색 그래프) 중 하나를 이용해 세포 수를 계산했습니다.
그림 3: EarlyTox Live/Dead Assay
MCF-7 세포는 24시간 동안 Staurosporine을 Serial Dilution하여 처리한 뒤, Molecular Devices의 EarlyTox Live/Dead Assay 키트를 이용하여 assay를 수행하였습니다. Live Cell은 Calcein AM(Green)으로, Dead Cell은 ethidium homodimer(Red)로 염색하였습니다. 이 Plate는 SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader로 측정하였습니다. 결과는 그린/레드 비율과 화합물 농도를 비교하여 그래프로 나타냈으며, IC50값이 21.2nM인 SoftMax Pro 소프트웨어를 이용하여 계산하였습니다.
Tip:
MCF-7 Cell은 크기가 불규칙한 다각형 Morphology를 가지며, 무리를 지어 큰 응집체를 형성하는 경향이 있습니다. StainFree Cell Counting의 경우, Create New Setting'으로 황색 Drawing Tool을 이용하여 세포 이미지의 경계선을 따라 세포의 범위를 지정합니다. 파란색 Drawing Tool을 사용하여 세포 경계 밖의 영역을 표시합니다. 기본 세팅된 설정 'CellsC'를 사용할 수도 있지만 다소 정확하지 않을 수 있습니다.
MCF-7 Cell 분석에 필요한 장비와 시약
- SpectraMax ® i3x Multi-Mode Microplate Detection Platform
- SpectraMax ® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax ® Pro Software
Imaging Cytometer
투과광(TL)
713nm(적색 형광)
TL 노출: 7ms
TL 초점 조절: -10µM
713 노출: 6ms
713 초점 조절: 0µm
Analysis type: Discrete Object Analysis
Wavelength for finding objects: TL(StainFree) 또는 713(적색 핵)
StainFree Cell Detection 기술에 관하여
Imaging을 기반으로 한 Cell-Based Assay는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 Fixed Cell을 사용하여 염색을 해야 하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence를 분석하는 경우, Label Free기법을 이용하면, Cell Viability에 영향을 주지 않고 Cell Proliferation과 Cell Viability를 정량적으로 Monitoring할 수 있습니다.
MiniMax 300 Imaging Cytometer가 장착된 SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, 세포 생장, 세포독성 및 다른 assay를 수행할 수 있습니다.