Cell Counter
Cell Counter: HUVEC Cells
Human Umbilical Vein Endothelial Cell(HUVEC)은 인간 탯줄의 정맥에서 분리된 Primary Cell입니다. 이 세포는 저산소증, 염증, 산화 스트레스, 감염 반응, 정상 및 종양 관련 혈관생성 등의 응용 분야에서 내피세포 기능을 연구하기 위해 사용되는 모델 시스템입니다. Endothelial Cell Activation은 면역반응으로 TNF-α 및 IFN-γ와 같은 Cytokine에 의해 유도될 수 있으며, 이로 인해 VCAM-1/CD106과 같은 Cell adhesion molecule의 발현이 upregulation됩니다. 이를 형광 label된 항체와 세포 이미징을 사용하여 정량할 수 있습니다.
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그림 1: StainFree 세포 계수
SpectraMax i3 Minimax 300 Imaging Cytometer를 사용하여 HUVEC을 이미징하였으며, 기본 설정 ‘CellsB’를 이용하여 Transmitted Light에서 촬영한 이미지 상에서 세포를 확인하였습니다. 좌측에 보이는 것은 Transmitted Light에서 촬영한 원본 이미지이며, 우측은 같은 이미지를 소프트웨어로 식별하여 세포를 보라색 마스크로 나타낸 것입니다. 고밀도(상단 행)와 저밀도(하단 행)로 Seeding된 세포를 나타냅니다.
그림 2: StainFree 세포 계수 vs. 형광 핵 계수
156 ~ 20,000 cell/well로 Seeding한 HUVEC은 StainFree 기술(청색 원)을 사용하여 계수되거나 EarlyTox™ Live Cell Red Dye로 염색하였으며, 핵은 Red Fluorescence로 counting되었습니다(적색 원). 두 가지 방법으로 얻은 세포 수를 비교했을 때 Cell Density가 높은 일치도를 보입니다.
그림 3: HUVEC에서의 Cytokine 에 유래된 VCAM-1/CD106 발현
Cytokine TNF-α 및 IFN-γ(좌측)로 처리되거나 미처리(우측)된 HUVEC은 VCAM-1/CD106에 대해 FITC 표지 항체로 염색하여 SpectraMax Minimax 300 Imaging Cytometer로 이미징하였습니다.
그림 4: HUVEC에서 Cytokine 유도 VCAM-1/CD106 발현의 억제
HUVEC은 96 well plate에 10,000 cell/well로 Seeding되었으며, Overnight으로 부착시켜 배양하였습니다. Cytokine TNF-α 및 IFN-γ를 비롯하여 서로 다른 농도의 p38 MAP Kinase 억제제 SB202190으로 24시간 동안 처리하였으며, FITC 표지 항체로 VCAM-1/CD106에 대해 염색하였습니다. 대조군에는 Cytokine과 Inhibitor를 처리하지 않았습니다.
Tip :
HUVEC 세포는 전형적인 조약돌 모양을 하고 있습니다. StainFree로 Counting할 경우, SoftMax Pro Software 이미지 분석에서 세팅 ‘CellsB’가 적합합니다. 또는 Cytokine으로 처리함으로 인해 Morphology가 변한 세포를 계수하는 경우, 새 분석 설정을 생성하여 세포 이미지 위에 그려 표시하면 도움이 될 수 있습니다.
HUVEC 세포 분석을 위한 장비와 시약
- SpectraMax ® i3 Multi-Mode Microplate Detection Platform
- SpectraMax ® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax ® Pro Software
Imaging Cytometer
Analysis type: Discrete Object Analysis
Wavelength for finding objects: TL
StainFree Cell Detection 기술에 관하여
Imaging을 기반으로 한 Cell-Based Assay는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 Fixed Cell을 사용하여 염색을 해야 하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence를 분석하는 경우, Label Free기법을 이용하면, Cell Viability에 영향을 주지 않고 Cell Proliferation과 Cell Viability를 정량적으로 Monitoring할 수 있습니다.
MiniMax 300 Imaging Cytometer가 장착된 SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, 세포 생장, 세포독성 및 다른 assay를 수행할 수 있습니다.