Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)는 인간 탯줄의 정맥에서 분리된 Primary Cell 입니다. 이 세포는 저산소증, 염증, 산화 스트레스, 감염 반응, 정상 및 종양 관련 혈관생성 등의 응용 분야에서 내피세포 기능을 연구하기 위해 사용되는 모델 시스템입니다. Endothelial Cell Activation 은 면역반응으로 TNF-α 및 IFN-γ와 같은 사이토카인에 의해 유도될 수 있으며, 이로 인해 VCAM-1/CD106과 같은 Cell adhesion molecule 의 발현이 upregulation 됩니다. 이를 형광 label 된 항체와 세포 이미징을 사용하여 정량할 수 있습니다.
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그림 1: StainFree 세포 계수
SpectraMax i3 Minimax 300Imaging Cytometer 를 사용하여 HUVEC을 이미징하였으며, 기본 설정 ‘CellsB’를 이용하여 Transmitted Light 에서 촬영한 이미지 상에서 세포를 식별하였습니다. 좌측에 보이는 것은 Transmitted Light 에서 촬영한 원본 이미지이며, 우측은 같은 이미지를 소프트웨어로 식별하여 세포를 보라색 마스크로 나타낸 것입니다. 고밀도(상단 행)와 저밀도(하단 행)로 Seeding된 세포를 나타냅니다.
그림 2: StainFree 세포 계수 vs. 형광 핵 계수
156 ~ 20,000 cell/well 로 Seeding 한 HUVEC은 StainFree 기술(청색 원)을 사용하여 계수되거나 EarlyTox™ Live Cell Red Dye로 염색하였으며, 핵은 Red Fluorescence 로 counting 되었습니다(적색 원). 두 가지 방법으로 얻은 세포 수를 비교했을때 Cell Density의 높은 일치도를 보입니다.
그림 3: HUVEC에서의 Cytokine 에 유래된 VCAM-1/CD106 발현
사이토카인 TNF-α 및 IFN-γ(좌측)로 처리되거나 미처리(우측)된 HUVEC은 VCAM-1/CD106에 대해 FITC 표지 항체로 염색하여 SpectraMax Minimax 300 이미징 세포분석기로 이미징하였습니다.
그림 4: HUVEC에서 Cytokine 유도 VCAM-1/CD106 발현의 억제
HUVEC은 96Well Plate 에 10,000 cell/well 로 Seeding 되었으며, Overnight 으로 부착시켜 배양하였습니다. Cytokine TNF-α 및 IFN-γ를 비롯하여 서로 다른 농도의 p38 MAP Kinase 억제제 SB202190으로 24시간 동안 처리하였으며, FITC 표지 항체로 VCAM-1/CD106에 대해 염색하였습니다. 대조군에는 Cytokine 과 Inhibitor 를 처리하지 않았습니다.
Tip :
HUVEC 세포는 전형적인 조약돌 모양을 하고 있습니다. StainFree 로 Counting 할 경우, SoftMax Pro 소프트웨어 이미지 분석에서 세팅 ‘CellsB’가 적합합니다. 또는 Cytokine 으로 처리함으로 인해 Morphology 가 변한 세포를 계수하는 경우, 새 분석 설정을 생성하여 세포 이미지 위에 그려 표시하면 도움이 될 수 있습니다.
HUVEC 세포 분석을 위한 장비와 시약
- SpectraMax® i3 Multi-Mode Microplate Detection Platform
- SpectraMax® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax® Pro 소프트웨어
| Parameter | 세포 계수를 위한 설정 | |
| Optical configuration | SpectraMax MiniMax 300 Imaging Cytometer |
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| Read mode | Imaging | |
| Read type | Endpoint | |
| Wavelength settings | Transmitted light | |
| Image acquisition settings | Exposure: 8ms | |
| Image analysis settings | Analysis type: Discrete Object Analysis Wavelength for finding objects: TL |
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| Find objects | Predefined setting: 'CellsB' or drawing | |
StainFree 염색 없는 Cell Detection 기술에 관하여
Imaging 을 기반으로 한 Cell-Based Assay 는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 고정된 세포를 사용하여 염색을 해야하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence 를 분석하는 경우, StainFree 기법을 이용하면, Cell Viability 에 영향을 주지 않고 Cell Growth 와 Cell Viability 를 정량적으로 Monitoring 할 수 있습니다.
MiniMax 300 Imaging Cytometer 가 장착된 SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, Cell Growth, Cell Viability 와 같은 다양한 분석을 수행할 수 있게 합니다.