Cell Counter
At The Cell Counter : HeLa Cells
HeLa 세포는 실험실에서 최초로 배양된 세포주이며, 오늘날에도 수많은 생물의학 연구 프로젝트에 사용되고 있습니다. 이 세포는1951년에 헨리에타 랙스(Henrietta Lacks)라는 환자에서 채취한 자궁경부암 세포에서 유래하였습니다. 이 환자는 이후 자궁경부암으로 사망하였습니다. 레베카 스크룻(Rebecca Skloot)의 베스트셀러인 ‘헨리에타 롭스의 불멸의 삶(The Immortal Life of Henrietta Lobs)’은 헨리에타의 삶과 유산에 대한 흥미로운 이야기를 들려줍니다.
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그림 1. 형광 Cell Counting와 비교한 StainFree 분석
HeLa 세포 계수는 StainFree™ 염색 없는 세포 검출 기술(Blue)과 적색 핵 염색(Red)을 이용하여 시행되었습니다. 두 방법 모두에서 얻은 Cell Counting 결과는 일치도가 높습니다. 이는 StainFree 기술을 이용해 염색을 하지 않고도 정확한 세포 계수가 가능하며 형광 염료를 사용할 필요가 없다는 점을 입증합니다(각 그래프당 r >0.99).
그림 2. StainFree 적용 영역 분석을 이용해 도출한 생장 곡선(Growth Curve)
HeLa Cell Seeding 농도: 4 가지 조건으로 96 well plate에 Seeding 250 (purple), 500 (blue), 1000 (green), and 2000 (red) cells per well. 투과광(TL) 채널을 이용하여 9일 동안 세포를 이미징하였습니다. 매 시점마다 Cell이 덮고 있는 부분에 대해 백분율을 StainFree 분석으로 결정하였습니다.
그림 3. StainFree 기술을 이용하여 측정한 세포독성
HeLa 세포는 1000 Cell/Well 로 Seed했으며, 하룻밤 Incubation 하였습니다. 그 다음, anisomycin(red circles)와 trichostatin(green circles)을 72 시간 동안 처리하였습니다. 세포독성은 StainFree 분석을 통해 세포 영역 백분율을 계산하는 방식으로 측정하였으며, SoftMax Pro 소프트웨어로 IC50 곡선을 그렸습니다.
그림 4. 독성 화합물로 처리한 HeLa 세포 이미지
Top row: low(left)/high(right) anisomycin 처리 후 Transmitted Light으로 Imaging하였습니다. Bottom row: low(left)/high(right) staurosporine를 처리하고, EarlyTox Cell Integrity Kit로 Cytotoxicity를 확인하였습니다. Live Cell은 Red 컬러, Dead Cell은 Red, Green 두 가지로 Label됩니다.
Tip 1:
염색 없이 HeLa Cell을 Counting하려면 SoftMax Pro Software에서 자동 프로토콜 ‘CellsA’를 사용할 수도 있고, 혹은 소프트웨어의 Drawing Tool을 이용하여 새롭게 분석도구를 생성할 수 있습니다. 사용할 분석 결과는 해당 세포의 Morphology와 생장 조건에 따라 달라집니다. 미리 설정된 세팅을 먼저 시도해보고, 어떻게 보이는지 확인해보세요.
Tip 2:
SoftMax Pro Software의 Field Analysis 기능을 사용하면 위와 같은 Growth Curve를 쉽게 구할 수 있습니다. Field Analysis는 사진에서 세포가 있는 영역의 백분율(Confluence)를 계산합니다. Cell Confluence를 계산하는 것은 분석법의 개발에 도움이 됩니다. 예를 들면 다양한 밀도에서 세포 assay를 시행할 수 있으며, 어떤 assay가 최선의 결과를 도출하는지 파악할 수 있습니다.
Tip 3:
시간 경과에 따른 세포독성의 모니터링은 어렵지 않습니다. 원하는 시점에 세포 영역의 백분율을 분석하고, SoftMax Pro 소프트웨어에서 그 결과를 그래프로 그리기만 하면 됩니다. 세포를 따로 염색하거나 세포를 떼어 별도로 회수하는 과정이 필요하지 않습니다.
HeLa Cell 분석에 필요한 장비와 시약
- SpectraMax® i3 Multi-Mode Microplate Detection Platform
- SpectraMax® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax® Pro Software
- EarlyTox™ Cell Integrity Kit
장비 설정 보기
Imaging Cytometer
Analysis type: Discrete Object Analysis
Wavelength for finding objects: TL
StainFree Cell Detection 기술에 관하여
Imaging을 기반으로 한 Cell-Based Assay는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 Fixed Cell을 사용하여 염색을 해야 하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence를 분석하는 경우, Label Free기법을 이용하면, Cell Viability에 영향을 주지 않고 Cell Proliferation과 Cell Viability를 정량적으로 Monitoring할 수 있습니다.
MiniMax 300 Imaging Cytometer가 장착된 SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, 세포 생장, 세포독성 및 다른 assay를 수행할 수 있습니다.