Cell Counter
Cell Counter: CHO Cells
CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포는 생물학과 의학 연구에 흔히 사용되는 Epithelial-like Cell Line입니다. 50년 전에 개발된 이 세포는 유전학부터 세포독성에 이르기까지 수많은 연구에 사용되어 왔습니다. Transfection 효율이 높아서, 치료제를 포함한 재조합 단백질의 제조용 세포주로 가장 많이 사용되고 있습니다.
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그림 1. SoftMax Pro 소프트웨어를 이용한 CHO 세포의 StainFree 분석
이 이미지의 CHO 세포는 384 well microplate에서 4000 Cell/well로 배양되었습니다. 좌측 이미지: 새로운 StainFree 분석 설정을 생성하려면, 개별 세포(Yellow) 혹은 세포가 없는 영역(Blue)을 나타내는 사진 위에 마우스로 ‘그리기’ 기능을 사용합니다. 우측 이미지: 자주색 마스크는 소프트웨어가 이미지 상에서 식별한 대상을 나타냅니다. 또는, 사전 정의된 이미지 분석 설정을 이용해 원클릭 분석으로 CHO 세포 수를 계산할 수 있습니다.
그림 2. 형광Cell Counting과 비교한 StainFree 기술
StainFree™ 세포 검출 기술(Blue), 적색 핵 염색(적색), 녹색 전체 세포 염색(Green)을 이용하여 계수한 세포. 세 가지 방법을 모두 사용해 구한 계수 결과가 거의 일치하므로, StainFree 기술로 정확하게 세포 계수가 가능하며 형광 염료를 사용할 필요가 없다는 점을 입증해 줍니다(각 그래프당 r >0.99).
그림 3. Cell confluence
Transfection 직전의 Cell Confluency를 StainFree 기술을 이용하여 측정하였습니다. 초기 Seeding 농도를 15000, 10000, 5000 cells/well로 지정합니다. Overnight 배양 후 Confluency를 측정한 결과는 각각 44, 30, 15입니다.
그림 4. GFP-transfected 세포의 imaging
Transfection된 세포를 SpectraMax MiniMax 300 Imaging Cytometer의 TL(A, C)과 녹색 형광(B, D)채널을 이용하여 Imaging하였습니다. 보이는 세포들은 15000 cell/well의 농도로 96 well plate에 Seeding되었습니다. (B) 낮은 transfection 효율성과 (D) 높은 transfection 효율성의 두 가지 transfection 조건으로 실험하였습니다. Individual Cell의 식별을 위해 StainFree 기술을 사용하였으며, GFP 발현에 따라 양성과 음성으로 확인될 수 있습니다.
Tip 1:
저는 염색 없이 CHO 세포의 수를 계산할 때, SoftMax Pro 소프트웨어의 사전 정의된 설정인 ‘Cells A’를 사용합니다. 이 방법은 5%에서 95% 사이인 컨플루언시의 CHO 세포에 효과가 높습니다. 상당히 동일한 샘플의 Stain-Free 계수와 형광 핵 계수 사이에서 우수한 상관관계를 발견할 수 있었습니다. (그림 2 및 3 참조).
Tip 2:
더 정확한 StainFree 계수값 얻기. TL 채널에서 Imaging을 하는 경우, 가능한 한 가장 선명한 이미지를 보여주는 높이를 Focus Adjustment에 사용하는 대신에 Focus Adjustment를 음의 방향으로 더 낮추도록 합니다(예: 0에서 -20). 여러분의 이미지에 있는 세포에 밝은 중심부와 어두운 가장자리가 생기게 됩니다. 이렇게 하면 많은 시간이 절약되며, 사전 정의된 분석 설정을 이용해 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.
CHO Cell 분석에 필요한 장비와 시약
- SpectraMax® i3 Multi-Mode Microplate Detection Platform
- SpectraMax® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax® Pro Software
장비 설정 보기
Imaging Cytometer
StainFree Cell Detection 기술에 관하여
Imaging을 기반으로 한 Cell-Based Assay는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 Fixed Cell을 사용하여 염색을 해야 하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence를 분석하는 경우, Label Free기법을 이용하면, Cell Viability에 영향을 주지 않고 Cell Proliferation과 Cell Viability를 정량적으로 Monitoring할 수 있습니다.
MiniMax 300 Imaging Cytometer가 장착된 SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, 세포 생장, 세포독성 및 다른 assay를 수행할 수 있습니다.