U937 세포는 1974년도에 37세 남성 환자의 histiocytic lymphoma 에서 분리되었습니다. 이 세포는 많은 Monocyte의 특징이 발현되는 세포주 중 하나이므로, Monocyte 의 행동과 분화를 연구하는 데 많이 사용됩니다. U937 세포를 Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor(GM-CSF, Okuma 외, 2000)로 처리하면 Apoptosis. 가 일어나게 됩니다. 때문에 세포사멸 신호전달 연구에 유용한 모델이 됩니다.
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그림 1: SpectraMax Minimax Cytometer 를 이용해서 얻은 이미지
U937 세포는 SoftMax Pro 소프트웨어의 사전 정의된 분석 설정인 'CellsC'를 사용하여 식별하였습니다. 좌측: 투과광 이미지, 우측: 소프트웨어가 식별한 세포를 나타내는 자색 마스크를 사용한 StainFree 분석.
그림 2: StainFree 세포 계수 vs. 형광 세포 계수
U937 Cell 을 156~20,000 cell/well 로 Seeding 하였으며, EarlyTox™ Live Green Dye 로 핵을 염색하였습니다. Image 는 각 웰당 하나의 사이트에서 촬영하였습니다. 이후, StainFree Technology (Blue) 를 이용하거나, Green Fluorescnece Nuclear (Green) 을 Counting 하여 각 이미지의 세포 수를 계수했습니다.
그림 3: EarlyTox Live/Dead Assay
U937 세포는 48시간 동안 0~20ng/mL 농도 범위의 GM-CSF(청색 그래프), TNFα(적색 그래프) 또는 TNFα + GM-CSF(녹색 그래프)로 처리되었습니다. 이후, EarlyTox™ Live/Dead Assay 키트를 사용하여 생존능에 대한 assay를 수행하였습니다. SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader 를 사용하여 형광을 측정하였습니다. Live/dead 의 형광 비율을 Cytokine 의 농도와 비교하여 그래프를 그렸는데, Cytokine 이 처리된 세포에서는 cell viability가 감소되었으며, 특히 TNFα 및 GM-CSF가 가 같이 처리된 경우 가장 Severe 한 결과가 나타났습니다.
그림 4: EarlyTox Caspase-3/7 R110 Assay
U937 Cell 은 48시간 동안 0~20ng/mL 농도 범위의 TNFα + GM-CSF(녹색 그래프), TNFα(적색 그래프) 또는 GM-CSF(청색 그래프)로 처리되었습니다. 이후, EarlyTox™ Caspase-3/7 R110 Assay를 이용하여 Caspase-3/7 활성에 대한 assay를 수행하였습니다. SpectraMax i3x 리더기를 이용하여 Caspase 활성을 나타내는 형광 신호를 검출하였습니다. TNFα 및 GM-CSF를 동시에 처리한 경우 가장 높은 Caspase 활성이 관찰되어, Caspase의 시너지 효과가 나타났습니다.
그림 5: EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 Assay
U937 Cell 은 48시간 동안 10ng/mL의 TNFα 및 GM-CSF(상단 행)으로 처리하거나, 미처리(하단 행)하였습니다. 이후, EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView™ 488 Assay를 사용하여 assay를 수행하였습니다. 녹색 형광을 측정하여 Active Caspase-3/7 Cell 을 확인하였습니다. 좌측 패널: Transmitted Light 이미지, 우측 패널: Active Caspase-3/7 Cell 을 나타내는 녹색 형광 이미지.
Tip:
U937 Cell 은 Suspension Culture하며 모양이 둥글기 때문에 계수가 쉽습니다. StainFree Counting 은, SoftMax Pro Software 의 Dropdown 메뉴에서 기본 구성인 'CellsC'를 사용하면 한 번의 클릭으로 세포 이미지를 간단히 분석할 수 있습니다.
U937 Cell 분석을 위한 장비와 시약
- SpectraMax® i3 Multi-Mode Microplate Detection Platform
- SpectraMax® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax® Pro 소프트웨어
| Parameter | 세포 계수를 위한 설정 | |
| Optical configuration | SpectraMax MiniMax 300 Imaging Cytometer |
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| Read mode | Imaging | |
| Read type | Endpoint | |
| Wavelength settings | 투과광(TL) 541nm(녹색 형광) |
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| Image acquisition settings | TL 노출: 7ms TL 초점 조절: -5µM |
541 노출: 1ms 541 초점 조절: 40µm |
| Image analysis settings | Analysis type: Discrete Object Analysis Wavelength for finding objects: TL(StainFree) 또는 541(녹색 핵) |
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| Find objects | TL: CellsC (기본구성) 541: 크기 및 강도 설정: 크기 = 10~30µm, 배경면 강도 = 150 |
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StainFree 염색 없는 Cell Detection 기술에 관하여
Imaging 을 기반으로 한 Cell-Based Assay 는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 고정된 세포를 사용하여 염색을 해야하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence 를 분석하는 경우, StainFree 기법을 이용하면, Cell Viability 에 영향을 주지 않고 Cell Growth 와 Cell Viability 를 정량적으로 Monitoring 할 수 있습니다.
MiniMax 300Imaging Cytometer 가 장착된 SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, Cell Growth, Cell Viability 와 같은 다양한 분석을 수행할 수 있게 합니다.