Cell Counter
Cell Counter: U937 Cells
U937 세포는 1974년도에 37세 남성 환자의 Histiocytic lymphoma에서 분리되었습니다. 이 세포는 많은 Monocyte의 특징이 발현되는 세포주 중 하나이므로, Monocyte의 행동과 분화를 연구하는 데 많이 사용됩니다. U937 세포를 Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor(GM-CSF, Okuma 외, 2000)로 처리하면 Apoptosis가 일어나게 됩니다. 때문에 세포사멸 신호전달 연구에 유용한 모델이 됩니다.
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그림 1: SpectraMax Minimax Cytometer를 이용해서 얻은 이미지
U937 세포는 SoftMax Pro 소프트웨어의 사전 정의된 분석 설정인 'CellsC'를 사용하여 식별하였습니다. 좌측: 투과광 이미지, 우측: 소프트웨어가 식별한 세포를 나타내는 자색 마스크를 사용한 StainFree 분석.
그림 2: StainFree 세포 계수 vs. 형광 세포 계수
U937 Cell을 156~20,000 cell/well로 Seeding하였으며, EarlyTox™ Live Green Dye로 핵을 염색하였습니다. Image는 각 Well당 하나의 사이트에서 촬영하였습니다. 이후, StainFree Technology(Blue)를 이용하거나, Green Fluorescence Nuclear(Green)을 Counting하여 각 이미지의 세포 수를 계수했습니다.
그림 3: EarlyTox Live/Dead Assay
U937 세포는 48시간 동안 0~20ng/mL 농도 범위의 GM-CSF(청색 그래프), TNFα(적색 그래프) 또는 TNFα + GM-CSF(녹색 그래프)로 처리되었습니다. 이후, EarlyTox™ Live/Dead Assay 키트를 사용하여 Viability에 대한 assay를 수행하였습니다. SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader를 사용하여 형광을 측정하였습니다. Live/dead의 형광 비율을 Cytokine의 농도와 비교하여 그래프를 그렸는데, Cytokine이 처리된 세포에서는 cell viability가 감소되었으며, 특히 TNFα 및 GM-CSF가 같이 처리된 경우 가장 Severe한 결과가 나타났습니다.
그림 4: EarlyTox Caspase-3/7 R110 Assay
U937 Cell은 0시간 동안 20~48ng/mL 농도 범위의 TNFα + GM-CSF(녹색 그래프), TNFα(적색 그래프) 또는 GM-CSF(청색 그래프)로 처리되었습니다. 이후, EarlyTox™ Caspase-3/7 R110 Assay를 이용하여 Caspase-3/7 활성에 대한 assay를 수행하였습니다. SpectraMax i3x 리더기를 이용하여 Caspase 활성을 나타내는 형광 신호를 검출하였습니다. TNFα 및 GM-CSF를 동시에 처리한 경우 가장 높은 Caspase 활성이 관찰되어, Caspase의 시너지 효과가 나타났습니다.
그림 5: EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 Assay
U937 Cell은 10시간 동안 48ng/mL의 TNFα 및 GM-CSF(상단 행)으로 처리하거나, 미처리(하단 행)하였습니다. 이후, EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView™ 488 Assay를 사용하여 assay를 수행하였습니다. 녹색 형광을 측정하여 Active Caspase-3/7 Cell을 확인하였습니다. 좌측 패널: Transmitted Light 이미지, 우측 패널: Active Caspase-3/7 Cell을 나타내는 녹색 형광 이미지.
Tip:
U937 Cell은 Suspension Culture하며 모양이 둥글기 때문에 계수가 쉽습니다. StainFree Counting은, SoftMax Pro Software의 Dropdown 메뉴에서 기본 구성인 'CellsC'를 사용하면 한 번의 클릭으로 세포 이미지를 간단히 분석할 수 있습니다.
U937 Cell 분석에 필요한 장비와 시약
- SpectraMax ® i3 Multi-Mode Microplate Detection Platform
- SpectraMax ® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax ® Pro Software
Imaging Cytometer
투과광(TL)
541nm(녹색 형광)
TL 노출: 7ms
TL 초점 조절: -5µM
541 노출: 1ms
541 초점 조절: 40µm
Analysis type: Discrete Object Analysis
Wavelength for finding objects: TL(StainFree) 또는 541(녹색 핵)
TL: CellsC(기본구성)
541: 크기 및 강도 설정: 크기 = 10~30µm, 배경면 강도 = 150
StainFree Cell Detection 기술에 관하여
Imaging을 기반으로 한 Cell-Based Assay는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 Fixed Cell을 사용하여 염색을 해야 하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence를 분석하는 경우, Label Free기법을 이용하면, Cell Viability에 영향을 주지 않고 Cell Proliferation과 Cell Viability를 정량적으로 Monitoring할 수 있습니다.
MiniMax 300 Imaging Cytometer가 장착된 SpectraMax i3/i3x Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, 세포 생장, 세포독성 및 다른 assay를 수행할 수 있습니다.