Cell Counter

Cell Counter: PC-12 Cell

1976년도에 Greene과 Tischler가 최초로 배양한 PC-12 Cell은 Rat Adrenal Medulla의 Pheochromocytoma(신경내분비종양)에서 유래했습니다. 이 세포는 모델 세포주로 개발되었으며 부신 크롬친화성 일차 세포 배양의 대안이 됩니다. PC-12 Cell은 신경 성장인자나 덱사메타손이 존재하는 경우 유사 신경세포로 분화될 수 있습니다. PC-12 Cell은 배양이 쉽고 분화능이 있어 약물 효능에서 신경분비에 이르는 다양한 연구 분야에 사용됩니다.

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그림 1. 형광을 이용한 Cell Counting과 비교한 StainFree 기술

PC-12 Cell은 StainFree™ Cell Detection Technology(청색 원)와 적색 핵 염색(적색 원)을 이용하여 Counting하였습니다. 두 방법으로 계산된 세포 수의 일치도가 높으므로, StainFree 기술로 정확한 세포 계수가 가능하며 형광 염료를 사용할 필요성이 없다는 점이 입증됩니다(각 그래프당 r2 >0.99).

그림 2. StainFree 적용 영역 분석을 이용해 도출한 생장 곡선(Growth Curve)

10일 동안의 PC-12 Cell Growth Curve Cell을 2000개(적색), 1000개(녹색), 500개(청색), 200개(자색)씩 Seeding하였습니다. 그 다음 SoftMax Pro Software의 Field Analysis 기능을 사용하여 24시간마다 Cell Confluence를 측정했습니다. 144시간(*) 뒤에 2,000개로 Seeding한 그룹의 Confluence가 감소하였는데, 이는 배양 배지의 영양소 고갈로 인한 것일 가능성이 높습니다. 배지는 3일마다 교체되었으나, 144시간 이후부터 매일 교체되었습니다.

그림 3. 미토콘드리아 염색을 이용한 PC-12 Cell의 StainFree 분석

상단 행에는 투과광 이미지가 적색 형광(미토콘드리아) 이미지와 중첩되어 나타납니다. 하단 행에는 소프트웨어로 식별한 개별 세포(자색 마스크)를 이용한 StainFree 분석이 표시되어 있습니다. 좌측: 약물을 처리하지 않은 세포, 우측: 1µM Valinomycin 처리 세포. 식별된 각 개별 세포에 대해 미토콘드리아 염색의 세기를 계산할 수 있습니다.

그림 4. Valinomycin으로 처리한 PC-12 Cell에 대한 IC50 그래프

Valinomycin으로 처리한 PC-12 Cell은 MitoTracker™ Deep Red FM(MTDR) 염색 시약을 이용하여 Mitochondria Activity Assay를 수행했습니다. 농도에 상응하는 Response를 StainFree기술(청색) 또는 형광 핵 염색(녹색)을 이용하여 확인하여 개별 결과를 그래프로 표시합니다. 평균 Mitochondrial Fluorescence와 Valinomycin 농도의 상관관계를 그래프로 보여줍니다. 두가지 분석 방법을 통해 서로 동일한 곡선을 얻었으며, 두 경우 모두 IC50 값이 57nM이었습니다.

Tip 1:

염색 없이 PC-12세포를 계수하려면, Software의 Drawing Tool을 사용하여 분석법을 새롭게 세팅할 것을 권장합니다. Discrete Object Analysis를 선택한 뒤, Drawin Tool로 세포가 있는 영역과 없는 영역을 최소/최대 이미지에서 지정합니다. 밀도가 높은 Cell Population을 더 정확하게 계수하려면, 세포의 경계선 바로 안쪽으로 영역을 지정합니다. 반대로, 소프트웨어가 이미지의 세포를 더 많이 Counting하는 경우에는 세포의 경계에서 살짝 바깥쪽으로 그려줍니다.


Tip 2:

SoftMax Pro Software의 Field Analysis 기능을 이용하여 Growth Curve를 쉽게 그릴 수 있습니다. Field Analysis는 사진에서 세포가 있는 영역의 백분율(Confluence)를 계산합니다. Cell Confluence의 측정은 더 나은 분석법 개발을 위해 가치있는 툴이 될 수 있습니다. 예를 들어, 2개 이상의 검사 밀도에서 세포를 시드하고, assay 직전 세포의 컨플루언스를 계산하며, assay 결과 획득에 있어 최상의 결과를 도출할 수 있는 컨플루언스 수치를 결정할 수 있습니다.

PC-12 Cell 분석에 필요한 장비와 시약


장비 설정 보기

Parameter
세포 계수를 위한 설정
생장 곡선 설정
Optical configuration
SpectraMax MiniMax 300
Imaging Cytometer
Read mode
이미징
Read type
Endpoint
Wavelength settings
Transmitted light
Image acquisition settings
Exposure: 5ms
Exposure: 7ms
Image analysis settings
Analysis type: 대상 탐지를 위한 불연속 개체 분석 파장: TL
Analysis type: Field Analysis Wavelength for finding objects: TL
Find objects
Predefined setting: CellsA
PC-12 배양의 경우, 사용자 정의 설정을 이용하면 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 이미지를 촬영하고 분석하는 세팅은 assay 조건, 이용된 Microplate, 그 외의 요인에 의해 달라질 수 있는 점을 참고해주세요.

StainFree Cell Detection 기술에 관하여

Imaging을 기반으로 한 Cell-Based Assay는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 Fixed Cell을 사용하여 염색을 해야 하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence를 분석하는 경우, Label Free기법을 이용하면, Cell Viability에 영향을 주지 않고 Cell Proliferation과 Cell Viability를 정량적으로 Monitoring할 수 있습니다.

MiniMax 300 Imaging Cytometer가 장착된 SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, 세포 생장, 세포독성 및 다른 assay를 수행할 수 있습니다.