Cell Counter
Cell Counter: HepG2 Cells
HepG2는 간세포암종(HCC) 환자의 간 조직에서 유래한 세포주로, 종종 HCC를 비롯한 약물 대사 및 독성 연구에 모델 시스템으로 사용됩니다. 상피조직 형태의 부착성 배양세포이며, 적은 규모로 응집하여 자라는 경향이 있어 각각의 세포를 Counting하는 일이 쉽지는 않습니다. 알맞은 배양 조건에서는 뚜렷한 Apical 및 Basal Surface를 형성하기 때문에 간 질환 연구에 사용할 수 있습니다.
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그림 1: StainFree determination of % covered area
SpectraMax Minimax 300 Imaging Cytometer를 사용하여 HepG2 세포를 이미징하였으며, 맞춤형 사용자 정의 영역 분석 설정을 이용하여 세포를 식별하였습니다. 좌측에 보이는 것은 Transmitted Light에서 촬영한 원본 이미지이며, 우측은 같은 이미지를 소프트웨어로 식별하여 세포를 보라색 마스크로 나타낸 것입니다. 비교를 위해 두 세포의 밀도를 표시하였습니다.
그림 2: StainFree vs. fluorescent analysis of % covered area
HepG2 cell을 234 - 30,000 cell/well의 Confluence로 Seeding하고, StainFree technology(blue dots)를 이용하여 분석하였으며, EarlyTox ™ Live Cell Assay를 이용하여 염색한 후에 형광 영역(green dots)을 분석하였습니다. 두 방법의 결과는 높은 연관성을 보였습니다.
그림 3: EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 Assay
대조군 배지(좌측 패널) 또는 200µM 캡사이신(우측 패널)으로 처리한 HepG2는 EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 Assay 키트를 사용하여 assay되었으며, 녹색 형광 및 투과광(TL) 채널의 SpectraMax Minimax 300 Imaging Cytometer를 사용하여 이미징하였습니다. Top row: 녹색 형광으로 표지된 사멸 세포가 보이는 형광 이미지. Bottom row: 대조군 세포에서 세포사멸을 최소화하였으며 처리된 세포에서는 약 100%의 세포사멸이 나타나 중첩된 TL 및 형광 이미지.
그림 4: EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 Assay(시간 경과)
4.5시간(적색 막대), 6시간(녹색 막대), 또는 22시간(청색 막대) 동안 200µM 캡사이신(좌측 막대) 또는 대조군 배지(우측 막대)로 처리한 HepG2. EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 Assay 키트를 사용하여 세포사멸을 평가하였습니다. 세포가 NucView 488 기질 5µM로 배양되었으며, 표시된 시점에서 이미징하였습니다.
그림 5: EarlyTox Caspase-3/7 R110 Assay 키트 및 EarlyTox Glutathione Assay 키트
200µM 캡사이신(각 쌍의 좌측 막대) 또는 대조군 배지(각 쌍의 우측 막대)로 처리한 HepG2는 Caspase 활성을 측정하는 EarlyTox Caspase-3/7 R110 Assay 키트(적색 및 녹색 막대) 또는 초기 지표이자 세포사멸과 연관된 Glutathione을 감소시키는 EarlyTox Glutathione Assay 키트(청색 막대)를 이용하여 assay를 시행하였습니다. 두 assay 모두 SoftMax Pro Software의 사전 디자인된 프로토콜을 사용하여 SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader에서 검출되었습니다.
Tip:
HepG2 세포는 육안으로 구분할 수 없는 불규칙한 형태인 세포의 Aggregate 혹은 Clump로 생장합니다. StainFree™ 기술을 통해 세포 영역을 구분하여 HepG2 Cell의 Growth나 Confluence를 손쉽게 정량할 수 있습니다. TL 채널에서 촬영된 이미지는 Field Analysis 설정을 사용하여 쉽게 분석할 수 있습니다. 사전 디자인된 ‘Cells' 분석 설정을 사용하거나 SoftMax Pro Software의 Drawing Tool을 사용하여 커스텀 분석을 디자인할 수 있습니다.
HepG2 Cell 분석에 필요한 장비와 시약
- SpectraMax ® i3 Multi-Mode Microplate Detection Platform
- SpectraMax ® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax ® Pro Software
장비 설정 보기
Imaging Cytometer
Analysis type: Field Analysis
Wavelength for finding objects: TL
StainFree Cell Detection 기술에 관하여
Imaging을 기반으로 한 Cell-Based Assay는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 Fixed Cell을 사용하여 염색을 해야 하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence를 분석하는 경우, Label Free기법을 이용하면, Cell Viability에 영향을 주지 않고 Cell Proliferation과 Cell Viability를 정량적으로 Monitoring할 수 있습니다.
MiniMax 300 Imaging Cytometer가 장착된 SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, 세포 생장, 세포독성 및 다른 assay를 수행할 수 있습니다.