Cell Counter
Cell Counter: HEK293-GFP Cells
HEK293, 293, HEK 세포로도 알려진 Human Embryonic Kidney 293세포는 인간 배아의 신장에서 유래한 세포주입니다. 1970년대 초, Alex van der Eb는 네덜란드 라이든 대학교에 있는 자신의 실험실에서 이 세포들을 분리하였으며, 이 실험실의 다른 구성원이 아데노바이러스로 이 세포를 Transformation 시켜 오늘날 사용되는 세포주가 탄생하게 되었습니다. HEK293 세포는 쉽게 자라고, Transfection도 쉬워 Transfection 기반 실험, 단백질 발현, 백신 생산에 광범위하게 사용되었습니다. 우리는 녹색 형광 단백질(GEP, GenTarget Inc.)을 이용하여 Lentivirus로 Transformation된 HEK293 세포를 Imaging하였으며, SpectraMax MiniMax 300 Imaging Cytometer로 Cell Confluence분석을 해 보았습니다.
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그림 1: StainFree를 이용한 HEK293-GFP 세포 식별
SpectraMax i3 Minimax 300 Imaging Cytometer를 사용하여 HEK293-GFP 세포를 이미징하였으며, Custom Field Analysis Setting을 이용하여 Cell을 확인하였습니다. 좌측에 보이는 것은 원본 투과광 이미지이며, 우측에는 소프트웨어가 식별한 컨플루언시 영역을 자색 마스크로 나타낸 동일한 이미지입니다.
그림 2: 세포 및 배경 영역 지정
이미지의 세포 영역(Yellow)과 배경 영역(Blue)을 지정하려면 SoftMax Pro Software에서 Drawing Tool을 사용합니다.
그림 3: MiniMax cytometer로 이미징한 HEK293-GFP 세포
HEK293-GFP 세포를 Well당 20000개, 5000개, 1250개의 세포로 시드하였으며, MiniMax cytometer의 녹색 형광 채널에서 이미징하였습니다.
그림 4: StainFree vs. 형광 분석
StainFree 분석(청색 원)과 형광(녹색 원) 분석에서 측정한 Confluency 영역 비교: StainFree 염색 없는 Confluence의 백분율 분석은 형광을 기반으로 분석된 결과와 거의 완벽하게 일치합니다.
Tip 1:
때로는 세포가 너무 뭉쳐 있어 개별의 세포를 구분하기 힘들 수도 있습니다. 이 경우에는, SoftMax Pro 소프트웨어의 Field Analysis 설정을 사용하여 세포가 있는 부분, 혹은 Confluency를 구할 수 있습니다. StainFree 분석은 Transmitted Light(TL) 채널에서 Imaging한 세포의 이미지를 사용할 수 있습니다. 일부 세포 유형에서는 소프트웨어에서 Predefined된 Cells 설정을 이용하면 세포가 존재하는 영역이 정확하게 자동으로 식별됩니다. HEK293의 경우, Predefined Setting에서 신뢰할 만한 결과를 보여줍니다. 이는 품질 관리 목적으로 Confluence를 추정할 때에도 사용할 수 있습니다.
Tip 2:
좀 더 정밀한 Confluency의 값이 필요한 경우, Custom, User-defined 설정을 이용합니다. 정확한 Cell Confluence 측정치를 구하기 위한 한 가지 방법은 Background Tool을 사용하여 Confluence 영역 경계 밖의 근접한 부분을 그려서 표시하는 것입니다. 이렇게 하면 세포 영역으로 계수가 되어버리는 Cell Bordering을 최소화 하는데 도움이 됩니다.
HEK293-GFP Cell 분석에 필요한 장비와 시약
- SpectraMax ® i3 Multi-Mode Microplate Detection Platform
- SpectraMax ® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax ® Pro Software
장비 설정 보기
Imaging Cytometer
Analysis type: Field Analysis
Wavelength for finding confluent areas: TL or 541
StainFree Cell Detection 기술에 관하여
Imaging을 기반으로 한 Cell-Based Assay는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 Fixed Cell을 사용하여 염색을 해야 하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence를 분석하는 경우, Label Free기법을 이용하면, Cell Viability에 영향을 주지 않고 Cell Proliferation과 Cell Viability를 정량적으로 Monitoring할 수 있습니다.
MiniMax 300 Imaging Cytometer가 장착된 SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, 세포 생장, 세포독성 및 다른 assay를 수행할 수 있습니다.