Cell Counter
Cell Counter: A431 Cells
Epidermoid Carcinoma 세포주 A431에서는 EGFR(epidermal growth factor receptor)가 비정상적으로 높은 수치로 발현됩니다. EGFR은 mammalian cell의 성장, 생존, 증식, 분화를 조절하는 역할을 하며, 이 세포주는 EGFR을 매개로 한 Signaling의 스터디 모델입니다. 이 세포주는 85세 여성 환자의 표피에서 유래하였고 D. J. Giard 등이 확립한 A431 세포는 세포 주기, 세포사멸, 암과 관련된 연구에서 가치 있는 모델 시스템으로 입증되었습니다.
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그림 1: SpectraMax Minimax Cytometer를 이용해서 얻은 이미지
A431 세포는 EarlyTox™ Live Red Dye로 염색한 다음 SpectraMax Minimax cytometer를 사용하여 이미징하였습니다. 세포를 식별하기 위해 custom setting을 사용하였습니다. 상단: 중첩된 투과광 및 적색 형광 이미지, 하단: StainFree 분석을 이용해 식별된 세포(자색 마스크는 소프트웨어로 식별한 세포를 나타냄).
그림 2: StainFree 세포 계수 vs. 형광 세포 계수
A431 세포를 156~20,000cell/well의 밀도로 Seeding한 이후, EarlyTox Live Red Dye를 사용하여 핵을 염색하였습니다. 웰당 세포 수가 4개인 영역에서 이미지를 획득하였으며, 분석을 위해 웰 중앙의 대상 영역을 선택하였습니다. 이후, StainFree 방법(청색 그래프) 또는 적색 형광 핵(적색 그래프) 중 하나를 이용해 세포 수를 계산했습니다.
그림 3: EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 Assay
A431 세포를 Staurosporine(적색 그래프), Camptothecin(녹색 그래프), Etoposide(청색 그래프)로 연속 희석하여 24시간 동안 처리한 뒤, EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView 488 Assay Kit를 이용해 세포사멸을 분석하였습니다. Caspase-3/7가 발현된 세포는 녹색 형광으로 염색하였으며, SpectraMax MiniMax cytometer로 이미지를 촬영하고 Counting하였습니다. 다음, SoftMax Pro 소프트웨어로 세포사멸을 카운팅하고, 이를 처리한 약물의 농도별로 분석해보았습니다.
Tip:
A431 세포는 상피조직 형태를 가지며, 군집 형태로 생장하는 경향이 있으므로 세포 계수가 어려울 수 있습니다. StainFree Cell Counting에서는 ‘Create New Setting'을 사용하여 세포 가장자리 바깥으로 벗어나지 않도록 세포의 윤곽선 주위를 황색 Drawing Tool로 표시합니다. 청색 Drawing Tool을 사용하여 세포가 없는 곳과 있는 곳을 표시합니다.
A431 세포 분석을 위한 장비와 시약
- SpectraMax ® i3 Multi-Mode Microplate Detection Platform
- SpectraMax ® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax ® Pro Software
Imaging Cytometer
투과광(TL)
713nm(적색 형광)
TL 노출: 7ms
TL 초점 조절: 0µm
713 노출: 12ms
713 초점 조절: 20µm
Analysis type: Discrete Object Analysis
Wavelength for finding objects: TL(StainFree) 또는 713(적색 핵)
TL: 새로운 설정 만들기(사용자 정의)
713: 크기 및 강도 설정: 크기 = 10~30µm, 배경면 강도 = 70
StainFree Cell Detection 기술에 관하여
Imaging을 기반으로 한 Cell-Based Assay는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 Fixed Cell을 사용하여 염색을 해야 하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence를 분석하는 경우, Label Free기법을 이용하면, Cell Viability에 영향을 주지 않고 Cell Proliferation과 Cell Viability를 정량적으로 Monitoring할 수 있습니다.
MiniMax 300 Imaging Cytometer가 장착된 SpectraMax i3/i3x Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, 세포 생장, 세포독성 및 다른 assay를 수행할 수 있습니다.