Cell Counter
Cell Counter: THP-1 Cells
40년도 더 전에 Acute Monocyte Leukemia의 환자 혈액에서 유래한 human monocyte cell THP-1은 백혈병 연구뿐만 아니라 Monocyte와 Macrophage의 기능 연구에도 광범위하게 사용됩니다. 일반적으로 THP-1 Cell은 Suspension Culture를 하지만, IL-8과 다른 Marker가 발현되는 Adherent Macrophage-like Cell로 분화를 유도할 수 있어 분화관련 모델 시스템으로 이용할 수 있습니다.
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그림 1: 분화되지 않은 THP-1 Cell의 StainFree 및 형광을 이용한 Nuclear Counting
156~20,000 cell/well로 THP-1 Cell을 Seeding하고, 그 다음날 Counting하였습니다. StainFree Technology(Blue) 혹은 EarlyTox Live Red Dye(Red)를 이용하여 핵을 염색한 뒤 Counting하였습니다. 두 방법으로 구한 세포 계수는 모든 세포 밀도에서 5% 이하의 차이를 보였습니다.
그림 2: MiniMax cytometer에서 확인한 Undifferentiated THP-1 cells imaged
A, EarlyTox Live Red Dye로 염색된 THP-1 cell B, 적색 형광 이미징 채널에서 SoftMax Pro Software로 식별한 세포를 나타내는 자색 개체 마스크. C, TL 채널에서 이미징한 세포. D, TL 채널에서 StainFree 분석으로 식별된 세포.
그림 3: 시간에 따른 THP-1 분화 과정
THP-1 cell은 20,000개 cell/well로 96 well black-wall, 투명 바닥 플레이트에 Seeding했습니다. 이 세포는 25ng/µL의 PMA 또는 DMSO Control로 처리하였습니다. 세포는 0일차, 첨가 후 1일차, 첨가 후 2일차에 이미징하였습니다. 황색 화살표는 편평한 형태의 부착된 분화 세포를 나타냅니다.
그림 4: THP-1 cell proliferation
StainFree 기술을 이용하여 PMA 처리군 또는 DMSO 처리 대조군 세포의 Cell Proliferation을 측정하였습니다. PMA 처리군에서는 Cell Proliferation이 중단되지만, Control의 Cell은 지속적으로 분열합니다.
그림 5: IL-8 ELISA
ELISA로 측정한 PMA 및 DMSO 처리된 THP-1 세포의 IL-8 농도. 24,000 cell/well로 세포를 Seeding하였고, 약물처리 48시간 이후에 Supernatant를 수집하여 분석에 사용하였습니다. 흡광 기반 IL-8 ELISA는 SpectraMax i3 Microplate Reader를 사용하여 검출하였습니다.
Tip :
미분화 THP-1 세포와 같은 현탁 세포의 경우, 노출 시간을 줄여 부유 세포로 인한 흐려짐 정도를 최소화할 수 있습니다. SpectraMax Minimax 300 Imaging Cytometer는 파장을 매우 빠르게 전환할 수 있어, 이미지 사이의 세포 움직임 정도를 최소화하고 다른 채널에서 촬영한 이미지를 더 잘 중첩할 수 있도록 합니다. 사전 정의된 TL 이미지 분석 설정인 'CellsC'는 둥근 형태의 현탁 세포에 적합한 반면, ‘CellsA’는 보다 편평한 분화 세포를 더 정확하게 식별합니다.
THP-1 Cell 분석에 필요한 장비와 시약
- SpectraMax ® i3 Multi-Mode Microplate Detection Platform
- SpectraMax ® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax ® Pro Software
Instrument Settings for imaging and cell counting
Imaging Cytometer
Analysis Type: Discrete Object Analysis
Wavelength for Finding Objects: TL or 713
StainFree Cell Detection 기술에 관하여
Imaging을 기반으로 한 Cell-Based Assay는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 Fixed Cell을 사용하여 염색을 해야 하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence를 분석하는 경우, Label Free기법을 이용하면, Cell Viability에 영향을 주지 않고 Cell Proliferation과 Cell Viability를 정량적으로 Monitoring할 수 있습니다.
MiniMax 300 Imaging Cytometer가 장착된 SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, 세포 생장, 세포독성 및 다른 assay를 수행할 수 있습니다.