Cell Counter
Cell Counter: RBL Cells
1970년대에 Rat Basophilic Leukemia(RBL) 세포주가 확립되어, 비록 완전하지는 않았으나 채취가 어려웠던 Mast Cell을 편리하게 얻을 수 있는 모델 시스템을 가지게 되었습니다. RBL-2H3 Cell은 Original RBL 세포의 Subclone 중 하나입니다. 이는 Mast Cell의 Secretion에 대한 Biochemical Pathway 연구에 사용되어왔습니다. 일부 RBL 세포주는 Suspension Culture하였으며, 나머지 세포주는 Adherent Culture하였습니다. 서로 다른 생장 조건이나 동일한 배양 내 세포의 형태가 다를 수 있으므로, 맞춤형 StainFree 분석 설정을 구성하면 정확한 세포 계수에 매우 유용합니다!
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그림 1: StainFree 세포 계수
SpectraMax i3 Minimax 300 Imaging Cytometer를 사용하여 RBL-1 세포를 이미징하였으며, 맞춤형 사용자 정의 영역 분석 설정을 이용하여 세포를 식별하였습니다. 좌측에 보이는 것은 Transmitted Light에서 촬영한 원본 이미지이며, 우측은 같은 이미지를 소프트웨어로 식별하여 세포를 보라색 마스크로 나타낸 것입니다.
그림 2: StainFree 세포 계수 vs. 형광 핵 계수
156~20,000cell/well로 RBL-1 Cell을 Seeding했고, StainFree 기술(청색 점)을 이용해 Counting하거나, EarlyTox™ Live Cell Red Dye로 염색한 뒤 붉은색 형광으로 염색된 핵을 계수하였습니다. 두 가지 방법으로 얻은 세포 수를 비교했을 때 Cell Density가 높은 일치도를 보입니다. 세포 계수는 사용자가 정의한 ROI(대상 영역) 내에서 측정되었습니다.
그림 3: FlexStation 6 Multi-Mode Microplate Reader를 이용한 FLIPR Calcium 3 Assay
RBL-2H3 Cell은 96 well plate에 30,000 cell/well로 Seeding하였으며, 하룻밤 동안 배양하였습니다. 다음 날 Growth Media를 제거하고, FLIPR® Calcium 6 Assay dye + Probenecid를 Well에 첨가하고, 세포를 2시간 동안 배양하였습니다. 이후, FlexStation® 3 Multi-Mode Microplate Reader를 이용하여 Kinetic Fluorescence Assay를 수행했습니다. 온 보드 피펫터를 이용하여 assay 웰에 작용제 ADP를 옮기는 동시에, 플레이트 리더기로 웰의 바닥에서 칼슘 동원을 나타내는 형광 신호를 측정하였습니다.
그림 4: FlexStation Multi-Mode Microplate Reader를 이용한 Fura-2 QBT 칼슘3 Assay
RBL-2H3 Cell은 96 well plate에 30,000 cell/well로 Seeding하였으며, 하룻밤 동안 배양하였습니다. 다음 날 Growth Media를 제거하고, 60분 동안 Fura-2 QBT™ Dye를 처리하였습니다. IC50 Study에서는 assay 수행 전 45분 동안 Inhibitor YM-58483을 첨가하였습니다. 이후, FlexStation 3 Multi-Mode Microplate Reader를 이용하여 Kinetic Fluorescence Assay를 수행했습니다. Onbord Pipette를 이용해 CaCl2를 EC80 농도(Inhibitor assay용, Blue) 에 이르게 하거나 Serial Titration(Red)하였습니다. Plate Reader를 이용하여 Calcium Mobilization을 나타내는 형광을 Well 바닥에서 동시에 측정하였습니다.
Tip :
RBL 세포의 현탁 배양 시 부착 세포가 일부 존재하는 경우가 많으므로, SoftMax Pro 소프트웨어의 사용자 생성 분석 설정으로 소프트웨어가 현탁 유형 형태의 세포만을 식별하고 부착된 세포를 제외하도록 ‘학습시키면’ 매우 유용할 수 있습니다. 형태가 다양한 부착 배양의 경우, 모양과 무관하게 모든 세포를 식별할 수 있도록 사용자 생성 분석 설정을 극대화합니다.
RBL 세포 분석을 위한 장비와 시약
- SpectraMax ® i3 Multi-Mode Microplate Detection Platform
- SpectraMax ® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax ® Pro Software
Instrument Settings for imaging and cell counting
Imaging Cytometer
Exposure: 7ms
Focus adjustment: 20µm
Analysis type: Discrete Object Analysis
Wavelength for finding objects: TL
StainFree Cell Detection 기술에 관하여
Imaging을 기반으로 한 Cell-Based Assay는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 Fixed Cell을 사용하여 염색을 해야 하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence를 분석하는 경우, Label Free기법을 이용하면, Cell Viability에 영향을 주지 않고 Cell Proliferation과 Cell Viability를 정량적으로 Monitoring할 수 있습니다.
MiniMax 300 Imaging Cytometer가 장착된 SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, 세포 생장, 세포독성 및 다른 assay를 수행할 수 있습니다.