Cell Counter
Cell Counter: NIH3T3 Cell
과학자 Goerge Todardo와 Howard Green 1963년도에 확립한 NIH3T3 세포주는 마우스의 배아 섬유아세포에서 유래되었습니다. 이 세포는 자발적으로 Immotarlized되었으며, 당시 배양 프토토콜 ‘3-day transfer, inoculum 3x10^5 cells’를 따서 명명되었습니다. Standard Fibroblast는 우수한 transfection 숙주이자, 유도 Stem Cell Pluripotency 실험의 모델로 알려져 있습니다. Human Embryonic Stem Cell Research에서 Feeder Cell로도 유용하며, NIH3T3의 Growth Factor는 Keratinocyte의 생장에 유리하므로 Keratinocyte의 배양에 자주 사용됩니다.
NIH3T3는 가늘고 긴 구조를 가졌으며 세포 크기가 다양하여 이미지 분석이 어려울 수 있습니다. 그러나 StainFree 기술을 사용하면 불규칙한 형태의 세포도 매우 정확하게 Counting할 수 있습니다.
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그림 1. StainFree를 이용한 NIH3T3 세포 분석
SpectraMax Minimax 300 Imaging Cytometer를 사용하여 NIH3T3 세포를 이미징하였으며, 기본 설정 ‘CellsB’ 프로토콜을 이용하여 세포를 식별하였습니다. 좌측에 보이는 것은 Transmitted Light에서 촬영한 원본 이미지이며, 우측은 같은 이미지를 소프트웨어로 식별하여 세포를 보라색 마스크로 나타낸 것입니다.
그림 2: NIH3T3 세포의 Cell Counting
NIH3T3 Cells는 96 well 플레이트에 1:2으로 Serial Dilution하여 Seeding했습니다. Cell은 고정한 후에 핵염색을 수행했습니다. 염색 후 SpectraMax Minimax 300 Imaging Cytometer로 적색 핵 염색(적색 곡선)이나 StainFree™ Cell Detection Technology(파란색 곡선) 중 하나를 이용하여 식별한 세포를 바탕으로 하여 Counting하였습니다. 두 계산 방법 모두 거의 동일한 결과를 산출하며 두 곡선 모두 r2>0.99입니다.
그림 3. NIH3T3 세포 염색
AlexaFluor 488-phalloidin과 Red Nuclear Dye로 염색된 NIH3T3 세포. SpectraMax Minimax 300 Imaging Cytometer로 세포를 이미징하였습니다.
Tip:
SoftMax Pro Software에서 기본 구성으로 들어있는 프로토콜 설정 중 하나를 이용하면 여러 개의 NIH3T3 culture의 Cell Counting이 쉬워집니다. 'CellsB' 또는 'CellsD' 설정을 사용하거나, Drawing Tool을 사용하여 특정 세포에 적합하도록 새로운 custom setting을 만들 수도 있습니다. 세포의 불규칙한 모양과 군집 형성 경향으로 발생하는 문제를 방지하기 위해서는 그리기 기능을 사용하여 원하는 세포 이미지의 외곽선을 따라 세포 영역을 지정해줍니다. 이 세포들은 길게 뻗어있기 때문에 이로 인해 Over-Counting될 가능성이 있습니다. 이를 방지하기 위해서 긴 세포의 모양이 별개의 세포로 Counting되지 않도록 Background Tool을 이용하여 표시하기만 하면 됩니다.
NIH3T3 Cell 분석에 필요한 장비와 시약
- SpectraMax® i3 Multi-Mode Microplate Detection Platform
- SpectraMax® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax® Pro Software
장비 설정 보기
Imaging Cytometer
StainFree Cell Detection 기술에 관하여
Imaging을 기반으로 한 Cell-Based Assay는 일반적으로 형광물질을 세포에 붙여야 하는데, 이는 살아있는 세포에 독성이 될수도 있고, 혹은 Fixed Cell을 사용하여 염색을 해야 하기도 합니다. Cell Counting, Cell Confluence를 분석하는 경우, Label Free기법을 이용하면, Cell Viability에 영향을 주지 않고 Cell Proliferation과 Cell Viability를 정량적으로 Monitoring할 수 있습니다.
MiniMax 300 Imaging Cytometer가 장착된 SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate 플랫폼에서 특허 출원 중인 유일무이한 기술, StainFree Cell Detection 기술을 이용할 수 있습니다. DNA에 삽입되는 DAPI나 장기적으로 세포에 독성이 되기도 하는 Live Cell Dye 등으로 세포를 염색하지 않고, 세포 생장, 세포독성 및 다른 assay를 수행할 수 있습니다.